利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

摘要

我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。

摘要

将基因固定在光刻结构化表面上，可在开放式的微流控生物反应器系统中研究区室化的基因表达过程。与其他构建人工细胞系统的方法相比，该装置可实现基因表达试剂的持续供给以及代谢废物的同步排出。这有助于长时间维持无细胞基因表达过程，对于实现动态基因调控反馈系统具有重要意义。本文提供了一种利用基于DNA链置换反应的简易光刻技术制备基因芯片的详细方案，该技术仅使用商业化组件。同时，我们还提供了将区室化基因与聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控系统集成的操作流程。此外，我们证明该系统可与全内反射荧光（TIRF）显微镜兼容，可用于直接观察DNA与表达混合物中分子之间的分子相互作用。

引言

无细胞基因表达反应在生物化学、生物技术及合成生物学的多种应用中备受关注。无细胞蛋白质表达对于制备高纯度蛋白质样品起到了关键作用，这些样品是大量结构生物学研究的基础。例如，无细胞系统已成功用于表达使用基于细胞的表达方法难以制备的蛋白质复合物¹或膜蛋白²。值得注意的是，无细胞基因表达反应还被用于解析遗传密码的结构，始于1961年Nirenberg和Matthaei的开创性实验³。

近年来，无细胞方法在生物技术和合成生物学领域重新受到关注^4,5,6无细胞系统可加入非生物化合物，且更易于组合不同生物来源的组分。⁷。尽管无细胞系统明显存在缺乏完整细胞环境的缺点 "生长与分裂"可以设想制备具有基本代谢功能的开放式无细胞生物反应器，在提供简单的碳源和能源输入后，使其合成代谢产物。⁸在合成生物学这一新兴领域中，无细胞系统有望表现出更高的可预测性 "底盘" 用于实现合成生物学功能。

目前，无细胞基因表达反应通常采用来自不同来源（如细菌、酵母、昆虫）的细胞提取物，或针对不同应用优化的转录/翻译系统来完成。例如， 原核生物 与 真核基因表达，膜蛋白生产 等等。）。V. Noireaux 及其同事最近提供了一种制备细菌细胞提取物（通常称为 TXTL）的常用方案⁹其生物物理特性已被充分表征¹⁰，并且TXTL系统已成功用于执行一系列复杂的生化任务： 例如， 功能性噬菌体的组装 通过 噬菌体基因组的无细胞表达¹¹细菌蛋白质丝状结构的合成¹²，或无细胞基因线路的构建与应用^13,14.

在无细胞合成生物学中，另一个广受欢迎的系统是PURE系统，该系统由纯化的组分重新构建而成^15,16。与TXTL系统相比，PURE系统不含核酸酶或蛋白质降解机制。虽然在线性DNA、RNA分子或蛋白质的降解方面，PURE系统的问题较少，但降解通路对于实现动态功能实际上具有重要意义。为了减少TXTL系统中线性基因模板因RecBCD导致的外切核酸酶降解，必须添加具有末端保护功能的GamS蛋白。TXTL系统和PURE系统目前均有商业化供应。

一个与无细胞生物学密切相关的话题是研究区室化对生化反应的影响，并进一步构建类似细胞的人工结构或原始细胞^17,18,19,20。人工细胞的研究通常涉及将生化反应系统包裹在由磷脂或其他两亲性分子形成的囊泡结构内部。尽管这类系统有助于探索区室化的基础特性，或细胞特性及自复制结构的形成机制，但它们面临封闭系统常见的问题：在缺乏功能性代谢系统和适当的膜转运机制的情况下，难以使区室内的反应长时间持续进行——燃料分子被消耗殆尽，而代谢废物不断积累。

利用光刻技术在类似细胞的区室内部实现遗传物质的空间组织，是区室化的一种有趣替代方案。十多年前，魏茨曼科学研究所的Bar-Ziv团队率先实现了将"基因固定在芯片上"的技术²¹。该技术需要解决的主要问题包括DNA在芯片表面的非特异性吸附以及蛋白质在芯片表面可能发生变性。Bar-Ziv 等人开发了一种专用的光刻胶，称为"Daisy"，其结构包含一个用于将光刻胶分子固定在二氧化硅表面的反应性末端硅烷，一个确保生物相容性的长聚乙二醇（PEG）间隔臂，以及一个光可裂解的头基团；该头基团在紫外光（UV）照射下会转化为反应性胺基。研究表明，Daisy可用于将长度为数个千碱基对（kbp）的基因级DNA分子固定在芯片表面。从高分子物理的角度来看，该体系代表了接枝在固体基底上的高分子刷结构。由于DNA具有聚电解质特性，这些高分子刷的构象受到渗透压及其他离子特异性效应的显著影响^22,23。

最重要的是，已有研究表明，固定在基底上的基因仍然具有功能，能够被转录并翻译成RNA和蛋白质。溶液中的RNA聚合酶可以接触到基因刷²⁴，且转录/翻译过程中复杂的生物大分子混合物在表面不会发生变性。将遗传组分固定在基底上的优势之一是，可在开放的微流控反应系统中对其进行操作，该系统可持续供给小分子前体，并能移除废物产物^25,26。

我们最近开发了该方法的一种变体，称为Bephore（意为生物相容性电子束和光刻胶）²⁷，该方法完全基于商业化组件，并利用序列特异性的DNA链侵入反应，实现了一种易于实施的多步光刻工艺，用于构建基于芯片的人工细胞。该工艺的示意图如下所示 图1基于含有光裂解基团的DNA发夹分子，这些分子被固定在生物相容性PEG上 层。发夹结构的光解会暴露出单链的趾部序列，通过该序列可使目标DNA分子（含有 "置换" DIS序列）可以连接 通过 由趾部介导的链入侵

尽管Bephore在实施上可能更为简单，但Daisy能够实现非常密集且清晰的"基因刷"，这在某些应用中具有优势。然而从原理上讲，Daisy和Bephore光刻技术可以很容易地结合使用。Huang et al.此前曾开发出一种利用DNA链置换在金表面构建DNA刷的相关光刻方法，但该方法尚未应用于无细胞基因表达的场景中^28,29。

在以下实验方案中，我们详细描述了利用Bephore方法制备用于无细胞基因表达的DNA刷的过程。我们介绍了基因芯片的制备方法，并演示了如何通过多步光刻技术实现基因在芯片上的空间有序固定。此外，我们还讨论了反应腔室的制备，以及如何应用微流控技术在芯片上进行基因表达反应。

方案

注意：各部分步骤的时间安排详见补充信息（第1节）。

1. 芯片制备

注意：作为基底，使用带有50 nm厚二氧化硅层的硅片（直径100 mm，厚度0.525 mm）或玻璃载片（24 mm × 24 mm，1.5号；22 mm × 50 mm，4号）。根据具体应用，其他尺寸和厚度可能更为合适。

1. 清洗基底 通过 RCA清洗程序（水、氨水溶液NH₃(aq) 30% 和过氧化氢 H₂O₂ 30%，比例为5:1:1
   1. 将水和氨水溶液在烧杯中混合，并将混合物加热至70 °C。 °在热板上边搅拌边加热。
   2. 加入过氧化氢和底物。为提高通量，可将多个底物（尤其是小型玻璃载片）置于聚四氟乙烯（PTFE）支架中。
   3. 30分钟后，取出基底，用洗瓶中的水彻底冲洗，并用氮气枪吹干。立即进行基底的聚乙二醇化（PEGylation）处理。
      注意：佩戴皮肤和眼部防护装备，并在通风橱中操作。切勿将废液容器完全密封，以便混合物产生的气体能够释放。
2. 基底的 PEG 化
   注意：Biotin-PEG-Silane 储液反复冻融会因空气中水分冷凝而导致硅烷反应活性降低。因此，应将 Biotin-PEG-Silane 分装至 5 mL 离心管中，每管加入适量体积例如 10-20 mg）并用干燥氩气填充，然后冷冻保存至使用。
   1. 将Biotin-PEG-Silane溶于干燥甲苯中，通过涡旋震荡溶解（5 mg/mL）。
   2. 将基底置于通风橱内的玻璃培养皿（直径120 cm，高2 cm）中。
   3. 用移液器吸取溶液（≈200 µ单个玻璃盖玻片使用 L，大面积硅片使用几毫升）滴加到基底上，覆盖整个表面，但避免溶液流至基底边缘。
   4. 盖上培养皿。为减少基质干燥，可加盖一张浸湿的纸巾。
   5. 30分钟后，加入约40 ml异丙醇，然后取出基底，再次用异丙醇彻底冲洗，并用氮气枪吹干（对于载玻片，注意PEG化的一面）。将基底避光保存至使用前。
      警告：佩戴皮肤和眼部防护装备，并在通风橱中操作。

2. 基因固定前的准备

注意：引物序列、DNA 修饰以及示例性 PCR 方案详见补充信息（第 2-4 节）。

1. 使用修饰引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因。其中一条引物携带荧光染料，用于荧光显微镜下的可视化；另一条引物通过三乙二醇间隔子与DIS序列分隔，以确保在PCR过程中DIS序列保持单链状态。
2. 使用离心柱纯化试剂盒纯化DNA，并使用吸光光度计测定其浓度。浓度不应显著低于100 nM。
3. 使用浓缩的5 M NaCl溶液将NaCl浓度调整至1 M。高盐浓度有助于DNA刷结构的组装过程²²。

3. 光刻技术

注意：光裂解 DNA（PC）只能在黄光环境下操作。可使用洁净室专用的黄色薄膜来过滤常规白光灯的光线。

1. 基底的制备
   1. 准备 Bephore-混合液（1 µM 链霉亲和素，1.5 µM PC DNA，7.5 µM PH DNA 溶于 1x PBS（磷酸盐缓冲液）和封闭液（10 µM 未标记的 DIS DNA，1 mg/mL BSA（牛血清白蛋白），溶于 1× PBS 中。两者均可在避光条件下于冰箱中保存数周。
   2. 将基底切割成较小的片状（几厘米大小）²) 使用玻璃刀切割，或用手术刀按压硅片边缘沿晶向线将其折断。作为简单的对准标记，用玻璃刀从基底中心向边缘划一条短划痕。用氮气枪吹去芯片表面的微小颗粒。
   3. 混合两滴双组分硅胶，搅拌均匀 例如 用移液器吸头取适量胶水，涂抹于芯片表面，使划痕末端周围的区域保持空白（图2A）。胶水可形成疏水屏障，有助于洗涤步骤的进行，并减少孵育过程中所需的DNA用量。在后续步骤中，该胶层可轻松剥离。
   4. 孵育 10 µL（或足以覆盖芯片所需的量）室温（RT）下的Bephore混合液滴加到芯片上。孵育期间，将芯片置于一个盒子中。 例如 一个部分装有水的移液器吸头盒，以减少蒸发。
   5. 孵育1小时后，用50 μL PBS缓冲液多次洗涤芯片（5次，每次50 μL） µ用1×PBS通过移液去除未结合的Bephore-mix。
   6. 尽可能吸去缓冲液，但不要让芯片干燥，并孵育10 µ在室温下将 L 的钝化混合液加到芯片上。
   7. 孵育2小时后，用50 μL PBS缓冲液多次清洗芯片（10次） µ使用1×PBS通过移液去除未结合的封闭剂。
2. 投影光刻
   注意：对于光刻，需使用带有60倍物镜的直立显微镜 可以使用水浸物镜。照明时间取决于物镜、光源、掩膜、基底（硅芯片或玻璃载片）以及所需的DNA表面密度。使用60倍物镜时 目标，典型的曝光时间范围从重叠区域的两步光刻（硅芯片15秒，玻璃载片45秒）不到一分钟，到完全曝光需2-3分钟。切勿在基底上方使用盖玻片（除熔融石英外），因其会阻挡紫外光。
   1. 将打印好的光掩膜（参见示例光刻掩膜的补充文件及补充章节5）裁剪至合适尺寸，以适配合适的掩膜 holder，该 holder 可插入场阑位置图2B）。对于精确的多步光刻，需将掩模与支架上的对准标记对齐。
   2. 将基底放置在显微镜载玻片上，并移至显微镜载物台。对于 Bephore 玻璃载玻片的图案化，插入黑色箔片（例如 在显微镜载玻片与Bephore载玻片之间放置印制光掩膜时剩余的遮光铝箔，以提供光刻所需的暗背景。
   3. 在照明光路中插入红色滤光片，聚焦到基底表面，并导航至将要曝光的基底区域。 例如 划痕尖端区域
   4. 插入掩模架，遮挡光源并更换为紫外滤光片（图2C在低光照强度下，打开快门并使用相机快速将掩模聚焦到基底上。
   5. 遮挡通往相机的光路，并以所需的曝光时间对基底进行高强度光照。
   6. 从显微镜上取下样品，并小心地尽可能去除基底上的缓冲液，但不要使其干燥。
   7. 加入10-20 µ将含有DIS序列的DNA溶液加入基底表面。将基底置于湿盒中以防止干燥。在室温下孵育2小时（微摩尔浓度的寡核苷酸）或数小时至过夜（约100纳摩尔浓度的千碱基对长DNA）。
   8. 从芯片上移下DNA，并用1×PBS缓冲液洗涤数次。为减少DNA的浪费（尤其是较长片段），可将从基底上回收的DNA储存起来并重复使用。
3. 多步光刻
   注意：为在单个区域内精确对齐两次或更多次曝光，请将样品保留在载物台上，以避免角度错位。确保芯片不干燥。若需在基底的不同区域定位多个DNA刷，则使用电动载物台移动至指定区域，或使用带有适当对齐标记的基底。
   1. 第一次曝光后（第3.2节），将带有DIS序列的DNA在基底上孵育。确保第一次曝光产生的所有结合位点均被占据至关重要。因此，孵育寡核苷酸（10 µM），室温孵育约 3 小时。
   2. 为了固定带有DIS标记的基因，将其置于基底上，在室温下孵育数小时或过夜，随后洗涤样品，并加入封闭混合液，在室温下继续孵育2小时。然后进行下一次曝光步骤。
   3. 对于额外的曝光，重复之前的步骤（3.2.3 - 3.3.2）。

4. PDMS 装置

注意：建议在洁净室中操作。聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件的制备遵循标准方案，如 McDonald 等人³⁰ 所述。

1. 母模的制备 通过 光刻技术
   1. 清洁硅片（76.2 mm 直径，525 µm厚度）在丙酮中超声处理5分钟（高功率），随后用异丙醇和去离子水冲洗。然后将晶圆置于150℃的热板上 °15 分钟，C
   2. 可选地，为了增强光刻胶在晶圆上的附着性，加入 2–3 mL 附着促进剂 并以3000 rpm转速离心30秒。将晶圆加热至120 °2分钟，温度为C
   3. 加入约 2–3 mL 光刻胶（参见 材料清单。将晶圆在500 rpm转速下旋转15秒，然后在3000 rpm转速下旋转30秒。这应得到约20 µm 厚的光刻胶层。将光刻胶层在室温下静置 10 分钟。
   4. 预曝光烘烤时，将晶圆置于50℃的加热板上 °2 分钟 95 °C，然后 85 °C °5 分钟，温度为 C
   5. 将晶圆置于具有隔室蓝图的光掩模下方。建议使用掩模对准器。光掩模的分辨率应为 64,000 dpi（参见光刻掩模的补充文件及补充章节 5）。
   6. 将晶圆用紫外光（I线，5-10 mW/cm²）照射1分钟²) 通过光掩模。
   7. 后烘步骤中，将晶圆置于 50 °℃ 2分钟，然后85℃ °在 5 分钟内升温至 C。让晶圆在室温下冷却并静置 1 小时。
   8. 将晶圆放入盛有显影液的培养皿中，轻轻摇动烧杯，显影3分钟。用异丙醇冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。将晶圆置于130 °C的加热板上 °45 分钟，4 °C
2. PDMS 装置的制备
   1. 将PDMS基础剂与PDMS固化剂按10:1的比例混合，倒入密闭容器中的晶圆上，直至晶圆表面形成约5 mm厚的液层。若需制备仅1 mm厚的PDMS器件，则改为以100 rpm转速对晶圆进行旋涂，持续2分钟。
   2. 将容器放入干燥器中，抽真空（约85 kPa）约30分钟。然后将PDMS加热至约70℃°在烘箱中于 C 下孵育 1–2 小时。
   3. 将PDMS装置从晶圆上分离。将PDMS切割成片状，使每一片包含一组独立的腔室。若需将PDMS连接至微流控系统，则在供给通道的两端打孔（直径1 mm），作为进样口和出样口。
   4. 用异丙醇和去离子水清洗聚二甲基硅氧烷（PDMS），并用氮气枪吹干。将PDMS置于无尘环境中保存。

5. 分隔化的基因表达

注意：以下步骤描述了用于在倒置显微镜上观察区室化基因表达的样品 holder 的组装过程（图3），该装置配备用于温度控制的笼式培养箱。该 holder 使用易于获取的材料和工具（3.5–5 mm 厚的聚氯乙烯（PVC）塑料板、螺丝和螺母、钻孔工具）制成，可根据不同类型的显微镜进行定制。5.1 和 5.2 中描述的步骤应同步进行，以确保 holder 的两个部分同时准备就绪。

1. 底部支架组装
   1. 制备带有对齐标记的 Bephore 芯片（例如 划痕）并使用双面胶带将其粘接到芯片支架上（图 3B芯片的尺寸应大于将覆盖它的PDMS装置。
   2. 将一个或多个基因固定在芯片上（参见第2和第3节）。
   3. 在底座中央孔洞周围涂抹少量真空润滑脂，然后插入芯片支架。
      注意：芯片支架现通过润滑脂与底部支架粘附，同时仍保留芯片在x-y平面内的可重新定位性。
2. 顶部固定装置组装
   1. 使用4.2.1步骤中的旋涂法制备带有隔室的薄PDMS芯片。将PDMS切割至尽可能小，保留一侧通道开口，以通过扩散实现废物和前体分子的交换。
   2. 用氧等离子体对玻璃盖玻片（24 mm × 24 mm，1.5号）和PDMS芯片背面（无微室一侧）进行清洗，处理时间为42秒（功率200 W，气压0.8 mbar，样品置于法拉第笼中操作）。
   3. 将PDMS芯片置于载玻片中央，使微室朝上。将载玻片与PDMS一起在70 °C下烘烤1 h。 °C.
   4. 在顶部固定器的大孔周围涂抹一些真空润滑脂。
   5. 实验开始前，用氧气等离子体对玻璃载玻片和PDMS芯片处理42秒，以使PDMS表面亲水。
   6. 将带有 PDMS 的载玻片放置在顶部支架上（ 图3C）并将玻璃片轻轻压到封片膏上（图3C).
3. 支架组件
   1. 准备 100 µ细胞-free表达系统的L，并置于冰上。
   2. 小心地从芯片上移除缓冲液，并用 10 µL 的无细胞表达系统。接着，加入 60 µ将无细胞表达系统加入芯片，并清除芯片边缘的双组分硅胶（已在之前步骤中清除） 图3B).
   3. 加入20 µ将表达系统液体滴加到PDMS上。将液滴放置到PDMS后，立即在体视显微镜下检查各隔室是否充分润湿且无气泡。若存在气泡，尝试用剩余的无细胞表达系统冲洗去除。
   4. 在体视显微镜下操作，使用夹持臂固定底部支架，以便双手可方便地接触两个螺钉和翼形螺母，从而组装支架的两个部件并对齐腔室与DNA刷。图3D- F).
   5. 将上部支架插入下部支架，并向下压至无细胞表达体系的液滴融合图3D通过体视显微镜检查各微区与对准标记是否位于x-y平面上相近的区域，否则抬起上部夹持器，重新调整载玻片在上部夹持器上的位置。
   6. 从底部拧紧翼形螺母，直至其接触支架的底面。在对齐 x-y 平面内的腔室与芯片的同时，小心地进一步紧固翼形螺母。 通过 芯片固定器底部的把手（图3E）。接触后，仅需非常轻柔地拧紧翼形螺母（图3F).
      注意：此步骤需要一定经验，且取决于实验装置。在显微镜下，PDMS与玻璃之间液体产生的干涉条纹可能表明施加的力过小，而微区中心处荧光强度（来自DNA刷或表达的蛋白质）降低则提示压力过高（另请参见补充信息第6节）。
   7. 在防蒸发罩内的海绵上喷水，然后将支架插入箱中。用5 mL注射器吸取双组分硅胶，并用其密封箱体。图 3G).
   8. 将样品转移至温控显微镜下，利用荧光显微镜对DNA刷及反应过程进行成像。即使在无光照条件下，DNA刷的荧光在无细胞表达系统中仍会逐渐减弱。然而，该DNA刷仍保持其活性，可通过同一刷状结构重复进行基因表达加以验证。
      注意：当使用 Bephore 玻璃载片替代硅芯片时，PDMS 与 Bephore 芯片的位置（上/下）可互换，从而可使用工作距离较小的物镜。

6. 微流控装置中的持续表达

注意：实验装置由图4A所示部件组装而成。温度控制载台的组装细节见补充信息（第7节）。

1. 无细胞表达系统与管路
   1. 在样品管中制备无细胞表达系统（约 200 µL）。可添加带有荧光染料标记的聚苯乙烯微球，以随后监测供给通道中的流速。
   2. 将管路连接至压力控制器。将管路置于可保持约12小时低温的大容量冰浴中。必要时补充冰块。
      注：作为压力控制器的替代方案，注射泵可在流体阻力变化的情况下仍提供恒定的无细胞表达系统流速， 例如 由于气泡的存在，可能有助于长期实验的进行。
   3. 将装有无细胞表达系统的管子连接到聚四氟乙烯（PTFE）管（内径0.8 mm），并使管子延伸至加热载台。将一支注射器针头（直径0.9 mm）折成1-2 cm长、末端钝化的数段，取其中一段插入PTFE管中，后续将用作与聚二甲基硅氧烷（PDMS）的连接件。尽量缩短载台与管子之间的管路长度（图4C).
   4. 用胶带将聚四氟乙烯（PTFE）管缠绕在连接至冰水储液槽和蠕动泵的较粗橡胶管上，以冷却 PTFE 管图4C).
2. 顶部固定装置组装
   1. 用氧气等离子体（42 s）清洗PDMS芯片的平整面，并将其放置在带有孔洞的显微镜载玻片上，孔洞位置与PDMS芯片的进样口和出样口相匹配（图4B）。可以使用玻璃钻孔头预先在玻璃上钻孔。确保微腔不朝向玻璃载片。
   2. 将双面胶带贴在PDMS支架的平整面，然后贴上一块黑色箔片（例如 避免来自胶带的背景荧光，在支架两个孔之间的区域使用光刻掩模进行处理。
   3. 将带有PDMS芯片的玻片粘附到载物片 holder 上。
   4. 将PDMS及附有玻璃片的PDMS支架置于等离子清洗仪中，用氧气等离子体处理（42秒）。
   5. 在顶部固定器的大孔周围涂抹真空润滑脂，并插入PDMS固定器（图4BPDMS 持载片现与上部持载片粘附，同时仍可在 x-y 方向上重新定位。
   6. 将PTFE管与注射器针头连接器连接至PDMS芯片的进样口。为便于通过顶部支架接触PDMS芯片，可在本步骤及后续步骤中短暂移除上层塑料板。
   7. 在出口处插入第二段聚四氟乙烯（PTFE）管（约5 cm），并连接注射器针头接头图4D).
   8. 将PDMS支架置于上部支架中，使其可在各个方向自由移动。将上部支架松放在加热台上，如 图4E 无需拧紧任何翼形螺母。
   9. 使用显微镜导航至PDMS微室的位置，并将其置于相机视野中心。此后切勿移动载物台。
   10. 将带有聚二甲基硅氧烷（PDMS）的上部夹具从载物台上取下。
3. 加热台和Bephore载玻片
   1. 将加热载台的温度设置为 37 °C
   2. 将带有基因刷的Bephore载玻片（4号）用双面胶带固定在倒置荧光显微镜的温控载物台上，使对准标记大致位于显微镜视野中心。此对准标记的位置可确保各微区大致降至相同区域。
   3. 在基因刷的相应荧光通道中拍摄图像，并标记其在相机图像中的位置。
   4. 从基因刷上移除缓冲液，但不要让其完全干燥。加入 20 µ将无细胞表达系统加入基因刷中，并用镊子移除硅胶粘合框。
4. 微流控装置的组装
   1. 向样品管加压，直至无细胞表达系统充满聚四氟乙烯（PTFE）管路，并出现在聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置底部。此外，用移液器加入10 µ将无细胞表达系统液体加入PDMS上的微腔室中。确保各隔室无气泡。
   2. 小心地将上部固定装置放至载玻片上，并将微腔与基因刷对齐。在PDMS与对齐标记尚未处于同一焦平面之前，利用PDMS固定装置背面的小螺丝，精确调整PDMS装置相对于基因刷的x-y位置和方向（图4E).
   3. 保持该位置，并通过拧紧连接顶部固定装置与显微镜载物台的螺丝上的蝶形螺母，将PDMS压在载玻片上（图 4E).
   4. 增加含有无细胞表达系统的管路中的压力，并通过供给通道监测荧光微球的流动（流速介于0.5至5之间） µ每小时1升推荐）（图 4F如有必要，可通过拧紧翼形螺母来增加 PDMS 对玻璃的压力。

结果

两步光刻： 图5 展示了在载玻片上进行两步光刻工艺的结果，该载玻片上具有重叠的荧光标记DIS链图案。

从基因刷表达荧光蛋白：图6 展示了从固定化DNA中表达荧光蛋白YPet的结果。我们在多个时间点通过部分漂白荧光蛋白并观察荧光信号的恢复情况来评估基因表达速率，忽略立即发生的恢复，因其并非由蛋白质表达引起。在表达两小时后首次漂白，荧光强度迅速恢复并超过漂白前的水平；而在表达四小时和六小时后，荧光强度未能恢复至先前水平，表明若无新鲜表达混合液的补充，反应在约3-4小时后即终止。

与微流控技术联用：通过向表达区室持续供给额外的前体分子，可延长基因表达的持续时间 通过 微流控技术

讨论

光刻前是一种用于DNA或RNA图案化固定的强大且多功能的技术。然而，该过程包含多个步骤，如果这些步骤发生改变，可能会导致系统失败或性能降低。

Bephore芯片制备过程中的一个关键步骤是基底的PEG化，该步骤可提供表面的生物相容性。此处，采用RCA程序进行清洗步骤至关重要，因为该步骤还能活化表面，以利于后续的硅烷化反应。在实际的PEG化过程中，基底必须始终保持湿润，不得干燥。此外，Silane-PEG-Biotin必须妥善保存，以维持其反应活性（见第1.2节），并避免发生交联。为评估PEG化的效果，可将基底与荧光标记的链霉亲和素孵育，并与未进行PEG化的对照组进行比较。成功完成PEG化的基底应比对照组结合显著更多的链霉亲和素。

此外，在光刻工艺的后期阶段，芯片的干燥会产生不利影响，导致 例如 已结合DNA的去除，或DNA向底物未曝光区域的更高吸附。

如上文（第3.2节）所述，光刻工艺的分辨率和所需的曝光时间取决于实验装置（物镜、光源， 等等。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带50 nm二氧化硅的硅片（Bephore基底）	Siegert Wafer		厚度（µm）：525 ±25，直径（mm）：100
硅片（用于PDMS主模具）	Siegert Wafer		厚度（µm）：525 ±25，直径（mm）：76.2（3”）
4号载玻片	Menzel		22 mm × 50 mm
1.5号载玻片	Assistent		24 mm × 24 mm
生物素-PEG-硅烷	Laysan Bio		分子量 5,000
无水甲苯	Sigma Aldrich (Merck)	244511
链霉亲和素	Thermo-Fisher Scientific	S888
DNA	Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion高保真PCR预混液（含HF缓冲液）	New England Biolabs	M0531S	PCR试剂盒
Wizard SV凝胶和PCR纯化系统	Promega	A9281	离心柱式PCR纯化试剂盒
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	无细胞表达系统
PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher Scientific	F8771
聚四氟乙烯管（内径：0.8 mm，外径：1.6 mm）	Bola	S 1810-10
EpoCore 20	micro resist technology GmbH		光刻胶
mr-Dev 600	micro resist technology GmbH		光刻胶显影液
Ti-Prime	MicroChemicals		粘附促进剂
双组分硅胶	Picodent	Twinsil
紫外防护黄色胶片	Lithoprotect (via MicroChemicals)	Y520E212
设备
光刻用掩膜板	Zitzmann GmbH		64,000 dpi，180 mm × 240 mm
正置显微镜	Olympus	BX51	用于光刻和荧光成像
60倍水浸物镜	Olympus	LumPlanFl	与Olympus BX51联用，数值孔径NA 0.9
20倍水浸物镜	Olympus	LumPlanFl	与Olympus BX51联用，数值孔径NA 0.5
相机	Photometrics	Coolsnap HQ	与Olympus BX51联用
光源	EXFO	X-Cite 120Q	与Olympus BX51联用
倒置显微镜	Nikon	Ti2-E	用于基因表达的荧光成像
4倍物镜	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	与Nikon Ti2-E联用
相机	Andor	Neo5.5	与Nikon Ti2-E联用
光源	Lumencor	SOLA SM II	与Nikon Ti2-E联用
培养箱笼式孵育器	Okolab	bold line	与Nikon Ti2-E联用
压力控制器	Elveflow	OB1 MK3
NanoPhotometer	Implen		用于DNA浓度测定
等离子清洗仪	Diener	Femto	200 W，法拉第笼内操作，气压0.8 mbar